Nuôi cấy mắt cây trong môi trường nuôi trồng (in vitro)

Nuôi cấy mắt cây trong môi trường nuôi trồng (in vitro)

Với kỹ thuật này cho cây lan mới sau này hoa sẽ trông giống cha mẹ chúng.

Chuẩn bị mắt cây

Ưu điểm của kỹ thuật này là cây mới sinh sản sau này hoa sẽ trông giống cha mẹ chúng. Chúng ta dùng kỹ thuật này để nhân giống: Phalaenopsis, Doritis pulcherima, Phaius tankervilleae và Chiloschista lunifera.

Mắt cây phù hợp là bạn cắt chéo với 1 cm ở trên và dưới mắt của nhánh (cây) hoa. Điều rất quan trọng là dùng dao bén bởi vì dao cùn làm các mô bị tổn thương rất nhiều.

Hãy cẩn thận gỡ bỏ vỏ bao mắt cây

Chất dung môi nào bạn xử dụng?
Để khởi đầu phát triển của "mắt ngủ" chúng ta hãy dùng chất dung môi gồm có cytocinins (chất kích thích sinh trưởng - phytohormon). Chúng ta dùng Sigma's P6793 (Phytotechlab P793) (Web site http://www.sigma-aldrich.com/).

Chuẩn bị dụng cụ:

Thiết bị cần thiết:
   
Bếp lò
Nồi nấu nước đường kính miệng 30cm
Đèn cồn (dùng sát trùng dụng cụ)
Bao tay cao su
Nhíp, kẹp (inox)
Dao mổ (inox)
Cái móc lấy hạt lan (dụng cụ cấy chuyền)

Đồ dùng cần thiết:

Ống nghiệm chứa môi trường cấy
Bình cấy (lọ, ống nghiệm...)
Giấy lau nhà bếp (kitchen paper)
Cồn 70%
Thuốc tẩy (như là Clorox) dùng tẩy trùng.
Lọ (hũ) có nắp vặn (như là hũ thức ăn trẻ em - babyfood jar)

Bỏ mắt cây vào lọ (flask): Ngâm mắt cây đã cắt vào cồn 70% vài giây. Sau đó đặt các mắt cây vào trong nước Oxi già 0,5% (hydrogen peroxide H₂O₂) trong 30 phút. Kế đó đặt chúng vào trong nước Oxi già (H₂O₂) 3% trong 15 phút. Sau 15 phút, đặt các mắt cây đã khử trùng (trong ống nghiệm) nằm trên vỉ trong vùng hơi nước sôi (vùng khử trùng). Bây giờ, lấy ống nghiệm và mở ra trên hơi nước sôi. Nắp đậy phải đặt trong miếng giấy nhà bếp (kitchen paper) tẩm cồn. Lấy cái nhíp và khử trùng bằng đèn cồn. Đưa cái nhíp vào vùng khử trùng (vùng hơi nước) và lấy một cái mắt cây đã đức ngâm trong dung dịch Oxi già và đặt nó với phần đuôi vào đắy lọ trong dung môi nuôi.

Kế tiếp, nhúng cái nhíp vào trong nước sôi để rửa sạch các chất dung môi bám vào nhíp và ngâm nhíp vào trong lọ cồn 70%. Đậy ống nghiệm lại (trên hơi nước sôi) và đặt nó trên bàn để dán nhãn. Với ống nghiệm kế tiếp bạn cũng làm giống như vậy.

Gợi ý: Để tạo dung dịch khử trùng có hiệu quả hơn, hãy nhỏ vài giọt nước rửa chén (dish washing solution) vào trong nước Oxi già.

Chăm sóc:

Đặt các ống nghiệm bạn đã làm các mắt cây vào nơi ấm và sáng (khoảng 20°C). Tránh ánh sáng mặt trời trực tiếp bởi vì ánh sáng mặt trời sẽ làm ống nghiệm trở nên nóng bên trong.

Bởi vì kích thước và cấu trúc của các mắt cây làm tỷ lệ nhiễm bệnh cao hơn dùng cách nẩy mầm không cộng sinh (asymbiotic seed germination). Như vậy, điều rất quan trọng là chúng ta phải kiểm soát mỗi ngày trong tuần đầu tiên ,nếu có triệu chứng nhiễm trùng. Nếu bạn tìm thấy nấm hay vi khuẩn, bạn có thể khử trùng n thêm một lần nữa.

Có nhiều mắt cây tiết ra các hợp chất (exudate phenolic compounds) vào trong dung môi nuôi cấy làm đen dung môi nuôi cấy. Các hợp chất tiết ra sẽ giết chết các mắt cây nếu bạn không thay dung môi nuôi mới. Nhiều mắt cây sẽ ngừng tiết ra các hợp chất sau 3 hay 4 lần thay.

Bởi vì kích thước và cấu trúc của các mắt cây làm tỷ lệ nhiễm bệnh cao hơn dùng cách nẩy mầm không cộng sinh (asymbiotic seed germination). Như vậy, điều rất quan trọng là chúng ta phải kiểm soát mỗi ngày trong tuần đầu tiên ,nếu có triệu chứng nhiễm trùng. Nếu bạn tìm thấy nấm hay vi khuẩn, bạn có thể khử trùng n thêm một lần nữa.

Có nhiều mắt cây tiết ra các hợp chất (exudate phenolic compounds) vào trong dung môi nuôi cấy làm đen dung môi nuôi cấy. Các hợp chất tiết ra sẽ giết chết các mắt cây nếu bạn không thay dung môi nuôi mới. Nhiều mắt cây sẽ ngừng tiết ra các hợp chất sau 3 hay 4 lần thay.

Chất điều hoà sinh trưởng (hormones)

Chất điều hoà sinh trưởng là các hợp chất hữu cơ hay nhân tạo mà tác động sự phát triển và nhân giống. Chúng sản sinh trong cây (như phát triển nụ) để kiểm soát sự phát triển.

Auxins: Auxins tác dụng tăng dài các tế bào, phát triển rễ và chồi tự hình thành. Chúng ngăn chận sự phát triển chồi nhánh (điều này chồi bảo đảm tính di truyền ổn định). Auxins thông thường dùng trong môi trường nuôi cấy mô, hoặc là phối hợp với cytokinins lúc tăng dài của thân hoặc không có cytokinins cho bộ rễ.

Cytokinins: trước đây gọi là kinins, đóng vai trò chính trong môi trường nuôi cấy mô để phân cắt tế bào, shoot multiplication và sự tăng trưởng của chồi nhánh. Chúng giúp làm chậm sự lão hóa, và chúng tác động chuyển hoá auxin. Nếu việc nuôi cây quá ốm yếu, tăng lượng Cytokynin sẽ giúp việc nuôi trồng ngắn hơn, thân mần khoẻ chắc.

Gibberellins: là một nhóm của chất liệu thiên nhiên xuất hiện với tác dụng phát triển tế bào và kích thích sự tăng dài của thân. Năm 1926 E. Kurasawa (người Nhật) ghi lại rằng việc nhiễm một loài nấm mốc (tên Gibberella fugikuroi), kết quả là hạt lúa phát triển nhanh hơn bình thường. Chất liệu đó là gibberellic acid, mà sau đó được người ta đã phân lập và kết tinh từ cả nấm mốc và thực vật.

Nguyễn Nam Sách
Phỏng dịch từ bài: 'Node culture'
Website http://www.orchideenvermehrung.a